PCR擴(kuò)增DNA片段

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction ,PCR)是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，1985年由Mullis等人創(chuàng)立。該技術(shù)能在幾小時的實(shí)驗(yàn)操作中，將認(rèn)為選定的一段DNA擴(kuò)增幾百萬被，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)、可用于基因克隆、定點(diǎn)突變及序列分析。也可用于基因表達(dá)調(diào)控研究、遺傳病和傳染病基因診斷、基因多態(tài)性分析和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。

PCR的工作原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，這將代待擴(kuò)增的DNA片段和其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)變性、退火及延伸三部反應(yīng)的多次循環(huán)，可使特定的DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加。可用公式Y(jié)=(1+X)表示，式中Y=DNA擴(kuò)增倍數(shù)，X=擴(kuò)增效率，n=循環(huán)數(shù)。如X=100%,n=20時，Y=1048576倍。PCR的一個循環(huán)為（1）加熱使模板DNA在高溫（94℃）下變性，雙鏈解開，這是變性階段；（2）降低溶液溫度，使引物在低溫下（50℃）與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是退火階段；（3）溶液溫度升至中溫（72℃），在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制七點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。通過改變反應(yīng)溫度即高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個階段，構(gòu)成PCR的一個循環(huán)。╮(╯_╰)╭循環(huán)一次，特定DNA片段拷貝數(shù)擴(kuò)大一倍。一般30次循環(huán)，DNA片段放大數(shù)百萬倍。

試劑

購買TaqDNA聚合酶，10x擴(kuò)增緩沖液，dNTP.

設(shè)計并合成與目的DNA兩側(cè)互補(bǔ)的引物。

制備模板DNA。用牙簽挑取單菌落懸浮到50ul的裂解液中（裂解液1%Triton X-100,20mmol/L Tris·Cl ph8.2 2mmol/L EDTA),95℃，10000rpm離心5min ，取5ul上清液用于總體積100ul的PCR反應(yīng)。

器械

PCR擴(kuò)增儀

臺式高速離心機(jī)

移液器

經(jīng)高壓滅菌后的離心管

電泳儀

實(shí)驗(yàn)方法

1、按一下次序，將下列成分在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合

滅菌水                                  30ul

10x擴(kuò)增緩沖液                           10ul

4種dNTP混合物，每種濃度為1.25mmol/L   16ul

引物1                                   100pmol

引物2                                   100pmol

模板DNA                                5ul

加水至終體積                            100ul

2、于94℃加熱反應(yīng)混合液5min，使DNA完全變性。

3、將1ul TaqDNA聚合酶加入仍處于94℃的反應(yīng)混合也中。

4、用100ul石蠟油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，放置水蒸發(fā)。

5、按94℃變性1min，50℃退火2min，72℃延伸3min次序重復(fù)魂環(huán)25-30次（為克隆目的）。末輪循環(huán)的72℃延伸時間為10min。

6、取出樣品離心管，自然冷卻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定或置-20℃保存。若有必要，可將移液器吸頭深入下層水相，將含DNA的水相移入一清潔管中，用等體積三氯甲烷抽提樣品以除去石蠟油。

注意事項(xiàng)：

1、TaqDNA聚合酶應(yīng)在臨擴(kuò)增前現(xiàn)加。

2、擴(kuò)增前需充分混勻反應(yīng)混合液。

3、所用離心管需經(jīng)高壓滅菌。

4、PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，引物濃度不宜過多。

5、引物設(shè)計要合理，一般引物長度為18-30個核苷酸，成對引物間的G+C含量應(yīng)相似。

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司